Nattokinase

PRINZIP

Nattokinase wirkt auf Fibrin, unterbricht die Peptidbindung und bildet säurelösliche Produkte mit niedrigem Molekulargewicht, die mit einem Spektrophotometer gemessen werden.

Eine Fibrinolityc-Aktivitätseinheit (FU) ist definiert als die Menge des Enzyms, die die Absorption des Filtrats bei 275 nm unter den im Verfahren angegebenen Bedingungen um 0,01 pro Minute erhöht.

REAGENZIEN der Nattokinase
1,0,05 M Boratpuffer (pH 8,5) - 9,54 g Natriumborat (Na 2 B 4 O 7 10 H 2 O) und 4,5 g Natriumchlorid (NaCl) werden in etwa 200 ml DI-Wasser gelöst. Stellen Sie den pH-Wert mit 1 N HCl auf 8,5 ein und geben Sie DI-Wasser hinzu, um 500 ml zu erhalten.
2.0.2N TCA - 8,17 g Trichloressigsäure (CCl3CO2H) werden in DI-Wasser gelöst, um 250 ml herzustellen.
3. Thrombinlösung - Injizieren Sie mit einer Spritze 5,0 ml 0,05 M Boratpuffer in eine Thrombinflasche (Sigma, T-6634). Rühren Sie es vorsichtig um, um sich vollständig aufzulösen. Übertragen Sie mit der Spritze 1-ml-Aliquots in Plastikfläschchen (100 Einheiten / Fläschchen) und frieren Sie sie zur Lagerung ein.
* Zum Zeitpunkt der Verwendung den Inhalt einer Durchstechflasche auf 4 ml 0,05 M Boratpuffer verdünnen und mit der Pipettenspitze mischen (bei der Durchführung des Assays dieselbe Spitze verwenden), um eine Endkonzentration von 20 U / ml zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass es vollständig aufgelöst ist.

4. Acetatlösung (pH 6,0) - 12,96 g wasserfreies Natriumacetat (CH 3 CO 2 Na) in DI-Wasser lösen, 2,38 ml 2 N Essigsäurelösung zugeben und mit DI-Wasser auf 100 ml verdünnen.

10% Triton X-100 - Löse 5,0 g Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol) in DI-Wasser unter Erhitzen und füge DI-Wasser hinzu, um 50 ml zu ergeben. In einer braunen Flasche aufbewahren.

5. Enzymverdünnungsmittel - 0,344 g Calciumsulfat, Dihydrat (CaSO42H2O) und 0,585 g Natriumchlorid (NaCl) werden in DI-Wasser gelöst, 2,0 ml Acetatlösung und 0,5 ml 10% ige Tritonlösung und DI-Wasser zugegeben 1 Liter.

6.Fibrinogensubstrat - 96,0 mg Fibrinogen (Sigma, Fraktion I Typ I-S, F8630) werden nach und nach unter leichtem Rühren 10,0 ml 0,05 M Boratpuffer zugegeben und vollständig in einem 50-ml-Becherglas gelöst. Täglich frisch zubereiten (* 1)

                                                                 

VORBEREITUNG DER PROBENLÖSUNG
Verdünnen Sie die Probe mit Enzymverdünnungsmittel, um eine korrigierte Absorption (A) des Filtrats zwischen 0,04 und 0,08 zu erhalten. Die Konzentration beträgt normalerweise 0,67 bis 1,33 FU / ml

VERFAHRENBEISPIEL Für Nattokinase

1. 1,4 ml Boratpuffer und 0,4 ml Fibrinogensubstratlösung in ein geeignetes Zentrifugenröhrchen pipettieren, vortexen und 5 Minuten in einem 37 ° C Wasserbad inkubieren.
2. Fügen Sie genau 0,1 ml Thrombinlösung hinzu und mischen Sie alles richtig auf dem Wirbel.
3.Nach genau 10 Minuten 0,1 ml der Enzymprobenlösung zugeben, 5 Sekunden lang mischen und bei 37 ° C inkubieren.
4.Nach 20 bzw. 40 Minuten nach Beginn der Reaktion 5 Sekunden lang mischen.
5.Nach genau 60 Minuten 2 ml TCA-Lösung zugeben, um die Reaktion zu stoppen, mischen und weitere 20 Minuten bei 37 ° C inkubieren.
6. 15 Minuten bei 5.000 U / min zentrifugieren.

7. 1 ml Überstand vorsichtig mit einer Pasteurpipette in eine QUARTZ-Küvette pipettieren und die Extinktion (As) bei 275 nm ablesen.

LEER
1. 1,4 ml Boratpuffer und 0,4 ml Fibrinogensubstratlösung in ein zentrifugiertes Reagenzglas geben und 5 Minuten in einem 37 ° C Wasserbad inkubieren.
2. Fügen Sie genau 0,1 ml Thrombinlösung hinzu und verwirbeln Sie sie.
3.Nach genau 10 Minuten 2 ml TCA-Lösung hinzufügen und 5 Sekunden lang mischen.
4. 0,1 ml Probe in die Lösung geben, 5 Sekunden lang mischen und genau 20 Minuten lang bei 37 ° C inkubieren.
5. 15 Minuten bei 5.000 U / min zentrifugieren.
6. 1 ml Überstand vorsichtig mit einer Pasteurpipette in eine QUARTZ-Küvette pipettieren und die Extinktion bei (Ab) 275 nm ablesen. (* 2)

BERECHNUNG
(As - Ab) 1 1
FU / g = _____________ x ________ x _______ x D.
0,01 60 0,1

D = Verdünnungsfaktor (1 / Gewicht (g / ml))

BESCHEINIGUNG ÜBER DIE ANALYSE

Verpackung und Lagerung

Verpackungsbeutel für feste Lebensmittel, 25 kg / Barrel.

Nattokinase sollte an trockenen, kühlen und gut belüfteten Orten aufbewahrt werden, fern von Sonne und Hitze.

Zahlung :T / T, Paypal, Western Union, Alibaba Trade Assurance, VISA, MasterCard, E-Checking, späteres Bezahlen, LC usw.