Alkalische Protease
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Alkalische Protease

Alkalische Protease sollte an trockenen, kühlen und gut belüfteten Orten ohne Sonneneinstrahlung und Hitze gelagert werden.

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Erzeugnis Schilderung


Anwendung und Prinzip

Diese alkalische Protease wird verwendet, um die Proteaseaktivität, ausgedrückt als PC-Einheiten, von Präparaten zu bestimmen, die von Bacillus subtilis var. und Bacillus licheniformis var. Der Assay basiert auf einer 30-minütigen proteolytischen Hydrolyse von Casein bei 37 ° und pH 7,0. Nicht hydrolysiertes Casein wird durch Filtration entfernt und das solubilisierte Casein wird spektrophotometrisch bestimmt.


Reagenzien und Lösungen der alkalischen Protease
Kasein Verwenden Sie Kasein von Hammarsten-Qualität (United States Biochemical Corp., Katalog Nr. 12840 oder gleichwertig).
Tris-Puffer (pH 7,0) 12,1 g Tris (hydroxymethyl) aminomethan in Enzymqualität (oder ein Äquivalent) werden in 800 ml Wasser gelöst und mit 1 N Salzsäure auf pH 7,0 titriert. In einen 1000-ml-Messkolben überführen, mit Wasser auf das Volumen verdünnen und mischen.
TCA-Lösung 18 g Trichloressigsäure und 19 g Natriumacetat-Trihydrat in 800 ml Wasser in einem 1000-ml-Messkolben lösen, 20 ml Eisessig zugeben, mit Wasser auf das Volumen verdünnen und mischen.
Substratlösung 6,05 g Tris (hydroxymethyl) aminomethan in Enzymqualität in 500 ml Wasser lösen, 8 ml 1 N Salzsäure zugeben und mischen. 7 g Casein werden in dieser Lösung gelöst und 30 Minuten in einem kochenden Wasserbad unter gelegentlichem Rühren erhitzt.
Auf Raumtemperatur abkühlen lassen und mit 0,2 N Salzsäure auf pH 7,0 einstellen, wobei die Säure langsam unter heftigem Rühren zugegeben wird, um eine Ausfällung des Kaseins zu verhindern. Übertragen Sie die Mischung in einen 1000-ml-Messkolben, verdünnen Sie sie mit Wasser auf das Volumen und mischen Sie.

Probenvorbereitung Bereiten Sie mit Tris-Puffer eine Lösung der Probenenzympräparation vor, sodass 2 ml der Endverdünnung zwischen 10 und 44 bakterielle Proteaseeinheiten enthalten.


Verfahren der alkalischen Protease
Pipettieren Sie 10,0 ml der Substratlösung in jedes einer Reihe von 25 × 150 mm-Reagenzgläsern, wobei Sie ein Röhrchen für jeden Enzymtest, ein Röhrchen für jeden Enzymrohling und ein Röhrchen für einen Substratrohling zulassen. Äquilibrieren Sie die Röhrchen für 15 Minuten in einem Wasserbad, das bei 37 ° ± 0,1 ° gehalten wird.
Starten Sie die Stoppuhr zum Zeitpunkt Null und pipettieren Sie schnell 2,0 ml der Probenvorbereitung in das äquilibrierte Substrat. Mischen und ersetzen Sie die Röhrchen im Wasserbad. 2 ml Tris-Puffer (anstelle der Probenvorbereitung) zum Substratrohling geben. Nach genau 30 Minuten 10 ml TCA-Lösung zu jeder Enzyminkubation und zum Substratrohling geben, um die Reaktion zu stoppen. Erhitzen Sie die Röhrchen weitere 30 Minuten im Wasserbad, damit das Protein vollständig koagulieren kann.
Schütteln Sie am Ende der zweiten Erhitzungsperiode jedes Röhrchen kräftig und filtrieren Sie durch 11 cm Whatman Nr. 42 oder ein gleichwertiges Filterpapier, wobei Sie die ersten 3 ml Filtrat verwerfen.
[Hinweis: Das Filtrat muss vollkommen klar sein.]
Bestimmen Sie die Absorption jedes Probenfiltrats in einer 1-cm-Zelle bei 275 nm mit einem geeigneten Spektrophotometer, indem Sie das Filtrat aus dem Substratrohling verwenden, um das Instrument auf Null zu setzen. Korrigieren Sie jeden Messwert, indem Sie den entsprechenden Enzymleerwert subtrahieren und den so erhaltenen Wert als AU aufzeichnen.

Standardkurventransfer 100,0 mg L-Tyrosin, chromatographisch oder gleichwertig (Aldrich Chemical Co.), zuvor bis zur Gewichtskonstanz getrocknet, in einen 1000-ml-Messkolben. In 60 ml 0,1 N Salzsäure lösen. Nach vollständiger Auflösung die Lösung mit Wasser auf das Volumen verdünnen und gründlich mischen. Diese Lösung enthält 100 µg Tyrosin in 1,0 ml. Bereiten Sie drei weitere Verdünnungen aus dieser Stammlösung vor, die 75,0, 50,0 und 25,0 µg Tyrosin pro ml enthalten. Bestimmen Sie die Absorption der vier Lösungen bei 275 nm in einer 1-cm-Zelle mit einem geeigneten Spektrophotometer gegenüber 0,006 N Salzsäure. Erstellen Sie eine Auftragung der Extinktion gegen die Tyrosinkonzentration.


Berechnung der alkalischen Protease
Eine bakterielle Proteaseeinheit (PC) ist definiert als die Menge an Enzym, die unter den Bedingungen des Assays das Äquivalent von 1,5 µg / ml L-Tyrosin pro Minute produziert.
Bestimmen Sie anhand der Standardkurve und durch Interpolation die Extinktion einer Lösung mit einer Tyrosinkonzentration von 60 µg / ml. Eine Zahl nahe 0,0115 sollte erhalten werden. Teilen Sie den interpolierten Wert durch 40, um die Extinktion zu erhalten, die der einer Lösung mit einer Tyrosinkonzentration von 1,5 µg / ml entspricht, und notieren Sie den so abgeleiteten Wert als AS.
Berechnen Sie die Aktivität der Probenenzympräparation anhand der Gleichung

PC / g = (AU / AS) × (22 / 30W)

wobei 22 das Endvolumen des Reaktionsgemisches in ml ist; 30 ist die Zeit in min der Reaktion; und W ist das Gewicht der ursprünglich entnommenen Probe in g.

Verpackung und Lagerung von alkalischer Protease

Verpackungsbeutel für feste Lebensmittel, 25 kg / Barrel.


Alkalische Protease sollte an trockenen, kühlen und gut belüfteten Orten ohne Sonneneinstrahlung und Hitze gelagert werden.

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